蛋白从头测序（De Novo Sequencing）是指在未知蛋白质序列的情况下，利用高分辨率的质谱技术直接解析其氨基酸序列的过程。不同于依赖数据库比对的同源序列分析方法，从头测序无需参考基因组或蛋白数据库，因此在研究未知物种、表观遗传修饰蛋白以及抗体药物研发等领域具有应用价值。基于质谱技术的从头测序通过分析酶解肽段的碎片离子谱图，结合算法推导序列，已成为该领域的核心方法，但其准确性受实验设计、仪器性能与数据分析策略的协同影响。

一、技术原理与核心挑战

质谱法蛋白从头测序依赖于肽段的气相碎裂与碎片离子检测。蛋白酶（如胰蛋白酶）将目标蛋白切割为肽段后，经液相色谱分离并电离，在质谱中通过碰撞诱导解离（CID）、高能碰撞解离（HCD）或电子转移解离（ETD）产生b/y型或c/z型碎片离子。通过解析碎片离子的质量差，可推断相邻氨基酸的排列顺序。

碎裂模式的优化是影响从头测序准确性的关键因素。当前最常用的碎裂方式包括碰撞诱导解离（CID）、高能碰撞解离（HCD）和电子转移解离（ETD）。其中，CID和HCD主要产生b/y离子，有助于肽段主链的序列推导，而ETD可以有效保留翻译后修饰信息，如磷酸化和糖基化。

然而，基于质谱技术的蛋白从头测序面临三重挑战：

1、序列覆盖度不足

单一蛋白酶酶切产生的肽段难以覆盖全序列，尤其对富含碱性/酸性氨基酸的区域；

2、碎片离子信息不完整

低丰度肽段或长肽段（>20 aa）的碎片离子易丢失，导致序列缺口；

3、翻译后修饰（PTM）干扰

修饰（如磷酸化、糖基化）改变肽段质量，增加序列推导复杂度。

二、实验设计的优化策略

1、多酶组合酶解提升序列覆盖度

单一胰蛋白酶酶切通常局限于特定位点，难以全面覆盖目标蛋白。结合Lys-C、Glu-C、Asp-N等其他蛋白酶，可产生更多重叠肽段，从而提升覆盖率。此外，针对难溶性蛋白（如膜蛋白），引入超声辅助酶解或使用适量变性剂以增强酶解效率。

2、梯度碎裂能量与多维分离技术

为提升长肽段碎片信息的完整性，采用阶梯式碰撞能量（Stepped CE）能够获得不同能量水平下的丰富碎片离子。结合二维液相色谱（2D-LC/nano-LC）等多维分离方式，有助于缓解复杂样本中低丰度肽段的离子抑制，提升分离效果。

3、高分辨率质谱与动态排除设置

采用轨道阱（Orbitrap）或飞行时间（TOF）质谱平台，保证质量误差控制在低ppm水平，以区分质量极接近的氨基酸残基（如Leu/Ile）。同时，通过设置合理的动态排除时间，避免对高丰度肽段的重复采集，提升低丰度肽段的检测概率。

三、数据分析算法的优化

1、基于图论的序列拼接

从头测序算法通过将碎片离子构建为节点，利用图论模型进行动态路径搜索，筛选出最优肽段序列。新型工具（如Novor、PEAKS）结合动态规划和碎片匹配评分，可有效提升复杂谱图的解析能力。

2、翻译后修饰的协同解析

针对修饰肽段，开放式修饰搜索（Open Search）算法允许在设定的质量偏移范围内识别未知修饰，配合修饰位点定位工具（如PTM-Score），可提高翻译后修饰的识别与定位精度。

3、长读长序列的补全策略

对于部分未被覆盖的蛋白序列，可通过Top-down质谱数据（完整蛋白碎裂）与Bottom-up数据（肽段）联合分析，互补填补序列缺失区域，从而实现更完整的序列拼接。

四、未来发展方向

1、新型电离源开发

如激光诱导声波解吸（LIAD）可减少肽段碎裂偏好性；

2、人工智能辅助验证

利用已知序列库训练模型，预测碎片离子模式以优化算法；

3、单分子测序技术整合

结合荧光标记单分子测序（如Edman降解微流控芯片），验证质谱推导的争议区域。

基于质谱的蛋白从头测序技术通过实验策略与计算算法的协同优化，正逐步突破灵敏度与准确性的瓶颈。随着高精度质谱仪、多维分离技术与智能解析工具的进一步发展，其将在未知蛋白功能挖掘、合成生物学元件设计等领域展现更广阔的应用前景。百泰派克生物科技提供从头测序服务，欢迎联系我们！

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

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6.致力于为您提供优质的生物质谱分析服务!

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